免疫原性（Immunogenicity）是指藥物和/或其代謝物誘發(fā)對(duì)自身或相關(guān)蛋白的免疫應(yīng)答或免疫相關(guān)事件的能力。當(dāng)治療類蛋白產(chǎn)品作為藥物時(shí)，會(huì)被機(jī)體識(shí)別為外來(lái)物質(zhì)而產(chǎn)生免疫應(yīng)答，但對(duì)于治療性蛋白的不必要或非預(yù)期的免疫應(yīng)答則會(huì)給藥物的安全和療效帶來(lái)風(fēng)險(xiǎn)，甚至?xí)驗(yàn)榭顾幙贵w和內(nèi)源蛋白交叉給病人帶來(lái)生命危險(xiǎn)。

機(jī)體的免疫反應(yīng)通常包括兩種類型，一種是固有免疫，主要包括皮膚、粘膜及體液中的殺菌物質(zhì)所構(gòu)成的第一道和第二道防線。另一種為適應(yīng)性免疫，又稱特異性免疫，也是免疫原性研究主要討論和監(jiān)測(cè)的范疇。適應(yīng)性免疫主要包括體液免疫（通過(guò)B細(xì)胞介導(dǎo)產(chǎn)生特定ADA）和細(xì)胞免疫（通過(guò)T細(xì)胞介導(dǎo)釋放細(xì)胞因子）。對(duì)于大多數(shù)藥物，不良免疫反應(yīng)通常由體液免疫介導(dǎo)，但對(duì)于細(xì)胞基因治療類的產(chǎn)品，除體液免疫外，還需要更多的關(guān)注細(xì)胞免疫。

免疫原性研究中檢測(cè)的抗體通常包括:(1)抗藥抗體(Anti-Drug Antibody,ADA):通常特指抗藥結(jié)合抗體;(2)中和抗體(Neutralizing Antibody,NAb):是指能夠干擾藥物與其靶點(diǎn)相互作用的抗藥抗體。中和抗體往往能夠極大的降低或中和藥物的藥效作用，所以必要情況下還需要開(kāi)展中和活性試驗(yàn)評(píng)估抗藥抗體對(duì)藥物的中和能力/程度。當(dāng)然，除了疫苗類產(chǎn)品以外，中和抗體通常都是非預(yù)期產(chǎn)生的抗體。

1.1內(nèi)源性因素

• 藥物的氨基酸序列：相比于人源化氨基酸序列，非人源氨基酸序列的藥物更易產(chǎn)生ADA。
• 結(jié)構(gòu)修飾：為了增強(qiáng)療效或改變半衰期，人為對(duì)序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾（包括唾液酸修飾、氨基酸位點(diǎn)突變、去海藻糖、融合蛋白、PEG化等）。這些結(jié)構(gòu)變化均是引起免疫原性發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素。
  
  
  1.2外源性因素
  
  
• 產(chǎn)品工藝：多聚體、雜質(zhì)、去末端氨基酸和降解。如藥物產(chǎn)品在制備過(guò)程中引入了較高水平的雜質(zhì)，包括多聚體、降解產(chǎn)物、變性蛋白等，則ADA的發(fā)生率會(huì)相對(duì)高一些。
• 制劑：輔料、包裝材料等。
• 治療相關(guān)因素：如給藥途徑、頻率等。相比于靜脈、口服給藥，通常采用皮內(nèi)、吸入給藥的途徑更易產(chǎn)生ADA；連續(xù)多次給藥相比于單次給藥ADA的發(fā)生率通常更高些。
• 患者相關(guān)因素：自身免疫性疾病患者的免疫系統(tǒng)通常處于激活狀態(tài)，一般更易產(chǎn)生ADA，相反如患者的免疫系統(tǒng)處于抑制狀態(tài)，則不易產(chǎn)生ADA。

免疫原性的產(chǎn)生影響廣泛，從無(wú)臨床意義抗藥抗體的暫時(shí)出現(xiàn)，到能夠改變藥物藥效或產(chǎn)生副作用，甚至嚴(yán)重到危及生命。主要影響以下幾方面：

• 安全性：ADA的產(chǎn)生會(huì)導(dǎo)致機(jī)體發(fā)生藥物過(guò)敏反應(yīng)；對(duì)于免疫調(diào)節(jié)類藥物，可能會(huì)導(dǎo)致免疫細(xì)胞過(guò)度活化，促炎性因子快速釋放而引發(fā)細(xì)胞因子風(fēng)暴；抗原抗體復(fù)合物的形成也會(huì)帶來(lái)安全風(fēng)險(xiǎn)。
• 藥效學(xué)：中和抗體的產(chǎn)生可能降低或中和藥物療效，改變藥物生物分布。
• 藥動(dòng)學(xué)：改變組織分布，改變清除率及體內(nèi)暴露量，干擾血藥濃度測(cè)定。

免疫原性研究貫穿藥物研發(fā)、非臨床研究、臨床研究、上市后藥物監(jiān)測(cè)的整個(gè)生命周期，是藥物研發(fā)的重要組成部分。在免疫原性全程式研究中，應(yīng)始終關(guān)注抗藥抗體生成與藥代/藥效動(dòng)力學(xué)、療效以及安全性之間的相關(guān)性。

治療性蛋白藥物通常具有種屬差異，基于動(dòng)物免疫原性研究結(jié)果預(yù)測(cè)人體免疫原性具有局限性。但是，在非臨床研究中進(jìn)行免疫原性評(píng)價(jià)仍然具有一定意義。免疫原性相關(guān)反應(yīng)可導(dǎo)致非臨床研究結(jié)果復(fù)雜化并難以解釋，免疫原性數(shù)據(jù)有助于安全性數(shù)據(jù)的整體解讀和分析。而臨床試驗(yàn)中對(duì)于抗藥抗體的檢測(cè)更是成為了藥監(jiān)局的監(jiān)管要求。

• 評(píng)價(jià)藥物通常包括治療性蛋白、多肽及其衍生物、ADC、細(xì)胞產(chǎn)品、基因治療藥物、病毒載體類藥物等。
  
• 免疫原性為定性研究，主要聚焦在抗藥抗體的檢測(cè)和表征。通常應(yīng)獲得ADA的發(fā)生率、滴度、存續(xù)時(shí)間和中和能力等數(shù)據(jù)；必要時(shí)可對(duì)抗體同種型、亞型、結(jié)合表位或與內(nèi)源性蛋白的交叉反應(yīng)性進(jìn)行確認(rèn)。
  
• 免疫調(diào)節(jié)類藥物需對(duì)動(dòng)物體內(nèi)毒性試驗(yàn)中的相關(guān)細(xì)胞因子變化水平進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并開(kāi)展體外細(xì)胞因子釋放試驗(yàn)。

ADA產(chǎn)生的機(jī)制主要包括兩種：T細(xì)胞依賴途徑和T細(xì)胞非依賴途徑。

• T細(xì)胞依賴途徑：藥物作為抗原被抗原提呈細(xì)胞（APC）攝取內(nèi)化，加工為抗原多肽片段；多肽-MHC II類分子與T細(xì)胞表面受體（TCR）識(shí)別并結(jié)合，激活T細(xì)胞；T細(xì)胞活化誘導(dǎo)B細(xì)胞增殖和分化為漿細(xì)胞，合成并分泌特定ADA（IgG）。此類型ADA免疫應(yīng)答作用強(qiáng)，持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。
  
  
• T細(xì)胞非依賴途徑：藥物可直接作用B細(xì)胞表面受體（BCR），誘導(dǎo)B細(xì)胞分化漿細(xì)胞；同時(shí)樹(shù)突細(xì)胞也可將藥物提呈至B細(xì)胞，誘導(dǎo)B細(xì)胞分化漿細(xì)胞，合成并分泌特定ADA（IgM為主）。因?yàn)樵撏緩經(jīng)]有T細(xì)胞輔助，產(chǎn)生的ADA主要為IgM型，親和力低、持續(xù)時(shí)間短、特異性差，且比T細(xì)胞依賴途徑的免疫應(yīng)答作用弱。

圖1. ADA的產(chǎn)生機(jī)制^[1]

ADA即為抗體，抗體是機(jī)體免疫系統(tǒng)在抗原刺激下，由B淋巴細(xì)胞或記憶細(xì)胞增殖、分化成的漿細(xì)胞產(chǎn)生的效應(yīng)免疫分子?？贵w介導(dǎo)體液免疫，主要分布在血清中，是可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白。

根據(jù)產(chǎn)生的抗體重鏈的不同，ADA通常分為以下五種類型：IgG、IgE、IgM、IgA、IgD。各個(gè)抗體類型的特點(diǎn)如下表所示。

在ADA分析方法開(kāi)發(fā)之前，應(yīng)充分了解目標(biāo)待測(cè)物，根據(jù)受試藥物性質(zhì)及特點(diǎn)選擇合適的分析方法，通常包括酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法（ELISA）、電化學(xué)發(fā)光法（ECL）、放射免疫分析法（RIA）、表面等離子體共振檢測(cè)法（SPR）、全自動(dòng)納升級(jí)免疫分析工作站Gyrolab等。其中，應(yīng)用最為廣泛的方法主要包括ELISA法和ECL法。

• 直接ELISA：此法的優(yōu)勢(shì)在于能夠增加低親和力抗體的檢測(cè)，但缺點(diǎn)是僅能檢測(cè)單一亞型，且具有種屬特異性。
  
  
• Bridging-ELISA：此法的優(yōu)勢(shì)在于能檢測(cè)各類抗體亞型，無(wú)種屬特異性，可高通量檢測(cè)，缺點(diǎn)是不易檢測(cè)到低親和力的抗體。目前，該法也是業(yè)內(nèi)ADA檢測(cè)應(yīng)用較為廣泛的方法。

  
  

• ECL法：該法基于MSD平臺(tái)，優(yōu)勢(shì)在于可以檢測(cè)所有亞型，無(wú)種屬特異性，同時(shí)可以檢測(cè)低親和力抗體，靈敏度和耐受性高。所以，這種方法在臨床檢測(cè)中的應(yīng)用也比較廣泛。

圖2. ELISA和ECL法檢測(cè)ADA的原理示意圖

NAb的檢測(cè)方法通常包括兩種，一種是基于細(xì)胞的生物學(xué)試驗(yàn)(cell based Assay，CBA)，一種是非細(xì)胞的配體競(jìng)爭(zhēng)性試驗(yàn)(non-cell competitive ligand-binding assay，CLBA)。這兩種方法的選擇通常基于以下幾個(gè)因素：①由藥物類型和藥物作用機(jī)理（MOA）決定；②方法性能（如數(shù)據(jù)的可靠性）；③藥物免疫原性的風(fēng)險(xiǎn)。目前，CBA法是被監(jiān)管部門認(rèn)為是衡量藥物產(chǎn)生中和抗體傾向的金標(biāo)準(zhǔn)。但對(duì)于拮抗型單克隆抗體通常首選CLBA（通過(guò)結(jié)合發(fā)揮作用的），受體激動(dòng)劑的藥物或者ADC藥物推薦首選CBA。以下為兩種方法優(yōu)劣勢(shì)的比較。

歐洲藥品監(jiān)管機(jī)構(gòu)（EMA）于2007年發(fā)布首版免疫原性評(píng)價(jià)的指導(dǎo)原則，并于2017年發(fā)布最終版本，適用的范圍包括蛋白質(zhì)、多肽及衍生物等。該版本對(duì)于免疫原性分析的技術(shù)細(xì)節(jié)并未作過(guò)多規(guī)定，申辦方可根據(jù)適用目的原則選擇最優(yōu)的方法來(lái)滿足監(jiān)管要求。

美國(guó)FDA于2014年首次發(fā)布了免疫原性評(píng)價(jià)指導(dǎo)原則。2016年，為適應(yīng)行業(yè)的發(fā)展及審評(píng)要求，又發(fā)布了針對(duì)ADA檢測(cè)方法開(kāi)發(fā)和驗(yàn)證的指導(dǎo)原則草案并于2019年正式生效。

國(guó)家藥品監(jiān)督管理局（NMPA）于2020年08月發(fā)布了《藥物免疫原性研究技術(shù)指導(dǎo)原則（征求意見(jiàn)稿）》，并于2021年03月發(fā)布正式版本，填補(bǔ)了我國(guó)免疫原性研究相關(guān)技術(shù)規(guī)范的空白。該版指導(dǎo)原則中對(duì)于免疫原性的整體評(píng)估策略與EMA、FDA指導(dǎo)原則基本一致，不同之處在于NMPA正式版對(duì)非臨床和臨床免疫原性分析方法的差別作了較為詳細(xì)的區(qū)分。

此外，相關(guān)組織協(xié)會(huì)（如歐洲生物分析論壇）也會(huì)定期召開(kāi)行業(yè)會(huì)議，發(fā)布免疫原性方面的白皮書(shū)，這些白皮書(shū)針對(duì)免疫原性的熱點(diǎn)問(wèn)題也會(huì)給予諸多指導(dǎo)。

圖3.免疫原性多層級(jí)策略示意圖

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