前言

基因治療通過轉(zhuǎn)移遺傳物質(zhì)（DNA或RNA）來修復(fù)、調(diào)節(jié)或替換異常或缺陷基因達(dá)到治療目標(biāo)疾病的目的。基因治療最重要的挑戰(zhàn)之一是將治療基因有效地傳遞至靶組織。因?yàn)槁鉊NA很容易被吞噬細(xì)胞或核酸酶從系統(tǒng)中清除，使用“載體”進(jìn)行基因遞送，才能確保目標(biāo)基因在靶細(xì)胞有效表達(dá)。其中病毒載體由于感染效率高，宿主細(xì)胞范圍廣而具有廣泛的應(yīng)用。事實(shí)上，近幾十年來，病毒載體介導(dǎo)的基因治療已用于治療癌癥、心血管、眼科、神經(jīng)、代謝、血液病等多種疾病的臨床研究與應(yīng)用。其中，腺相關(guān)病毒（Adeno-associated virus, AAV）載體是基因治療的首選載體。

明星載體AAV

AAV是一種單鏈DNA細(xì)小病毒，大小約為20-25 nm，無法自主復(fù)制，依賴于腺病毒或單純胞疹病毒輔助進(jìn)行增殖。野生型AAV在人類中是非致病性的，感染個(gè)體后產(chǎn)生的免疫應(yīng)答水平極低，可以感染分裂和非分裂的細(xì)胞，這是AAV能夠應(yīng)用于基因治療的基礎(chǔ)。

AAV基因組大小約4.7kb，包括rep基因和cap基因，兩側(cè)有兩個(gè)反向末端重復(fù)序列（ITR）。rep基因編碼Rep78、Rep68、Rep52和Rep40，負(fù)責(zé)AAV基因組復(fù)制和病毒粒子組裝。cap基因編碼三種衣殼蛋白（VP1、VP2和VP3），并在不同閱讀框編碼組裝激活蛋白（AAP）。

野生型AAV基因組[1]

作為基因治療載體的重組腺相關(guān)病毒（Recombination Adeno-associated virus, rAAV）在非致病的野生型AAV基礎(chǔ)上改造而成。用含有啟動(dòng)子、治療基因和poly A的表達(dá)盒替代rep和cap基因，保留兩側(cè)對(duì)rAAV增殖必需的ITR。由于不含rep基因，rAAV轉(zhuǎn)基因以游離體的形式長期存在，整合到宿主基因組的概率極低。目前，可通過多種方式在體外生產(chǎn)攜帶治療基因的rAAV載體。

多種rAAV的生產(chǎn)方式[1]

眾多的AAV血清型是AAV載體應(yīng)用廣泛的又一原因。不同的AAV血清型具有不同的結(jié)合受體和組織趨向性，研究者可根據(jù)適應(yīng)癥選擇天然血清型，或?qū)AV衣殼蛋白進(jìn)行理性設(shè)計(jì)，組合衣殼蛋白突變，產(chǎn)生全新的AAV載體，以應(yīng)對(duì)患者預(yù)先存在的免疫中和。

AAV衣殼設(shè)計(jì)[2]

迄今為止，已分離和研究了至少12種天然血清型和100多種AAV變體作為基因遞送載體，并不斷產(chǎn)生新AAV突變體，優(yōu)化基因遞送。多種AAV血清型已應(yīng)用于各種疾病患者的臨床試驗(yàn)，包括天然血清型（AAV1、AAV2、AAV5、AAV6、AAV8、AAV9和AAVrh10）和AAV突變體（AAV2.5、AAV Spark100、AAV.7m8和AAVtYF等）。 

綜上，由于種類多樣、免疫原性極低、安全性高、宿主細(xì)胞范圍廣、擴(kuò)散能力強(qiáng)、體內(nèi)表達(dá)基因時(shí)間長等原因，rAAV被視為最有前途的基因治療載體之一。

AAV基因療法在腫瘤治療中的應(yīng)用與挑戰(zhàn)

癌癥本質(zhì)上是一種基因突變疾病。因此，基因治療是治療癌癥的一種非常有前景的技術(shù)。迄今為止，大多數(shù)基因治療臨床試驗(yàn)針對(duì)肺、皮膚、神經(jīng)和胃腸道腫瘤，采用了多種治療策略，如抗血管生成因子、腫瘤抑制劑、免疫刺激和溶瘤病毒。

使用AAV載體針對(duì)單基因疾病的基因治療已開始達(dá)到預(yù)期，過去幾年成功治療了多種基因缺陷疾病（如脂蛋白酯酶缺乏癥、脊髓型肌萎等），治療藥物陸續(xù)上市。然而，癌癥治療的成功水平遠(yuǎn)遠(yuǎn)落后于單基因疾病。

使用AAV基因療法進(jìn)行腫瘤治療存在兩項(xiàng)主要的挑戰(zhàn)：

（1）與單基因突變疾病不同，癌癥是一種（獲得性）多基因突變遺傳疾病，且存在大量遺傳異質(zhì)性。除非使用通用的校正基因，否則需要同時(shí)轉(zhuǎn)移多基因才能達(dá)到修復(fù)腫瘤細(xì)胞異?；蛲蛔?，且需要對(duì)每個(gè)患者量身定制。

（2）通常只需要一小部分靶細(xì)胞成功導(dǎo)入治療基因即可改善大多數(shù)單基因突變疾病的臨床癥狀。但在癌癥治療中，少部分靶細(xì)胞發(fā)生基因糾正不足有效治愈腫瘤。

因此，使用AAV載體進(jìn)行腫瘤基因治療的許多策略不是針對(duì)腫瘤本身，而是作用于宿主組織，針對(duì)腫瘤微環(huán)境或刺激宿主免疫反應(yīng)?；贏AV進(jìn)行腫瘤治療的策略包括：表達(dá)抗血管生成基因、細(xì)胞毒性或自殺基因、刺激免疫系統(tǒng)的細(xì)胞因子、腫瘤抑制和抗腫瘤基因、編碼小RNA的DNA、刺激抗原呈遞細(xì)胞的抗原和阻斷信號(hào)的抗體。

基于AAV載體的腫瘤治療策略[4]

此外，在《AAV-mediated in vivo CAR gene therapy for targeting human T-cell leukemia》研究中Waqas Nawaz等描述了一種方法，即通過注射攜帶CAR的AAV載體，在宿主體內(nèi)產(chǎn)生人類CAR-T細(xì)胞。在白血病腫瘤模型小鼠中單次注射AAV-CD4 CAR載體，即可產(chǎn)生足夠數(shù)量的有效體內(nèi)CAR-T細(xì)胞，使腫瘤消退。

體內(nèi)產(chǎn)生的AAV-CD4CAR T細(xì)胞介導(dǎo)的抗腫瘤活性[7]

目前，AAV基因藥物的安全性，及其在腫瘤臨床前模型中良好的治療結(jié)果，加上在單基因疾病中的臨床成功，促使針對(duì)腫瘤的AAV基因治療推向臨床試驗(yàn)。并且，通過合理的設(shè)計(jì)與策略選擇，克服其缺陷與局限性，將會(huì)大力推進(jìn)AAV載體在臨床的廣泛應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)：

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[7]Nawaz,W.etal.AAVmediatedinvivoCARgenetherapyfortargetinghumanTcell leukemia. Blood Cancer J 11, 119 (2021).