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有濟(jì)說 | 眼科藥物非臨床藥代動力學(xué)研究策略

眼是我們通向世界的窗戶，隨著世界人口老齡化程度的提高、生活方式的改變，白內(nèi)障、青光眼、年齡相關(guān)性黃斑變性（AMD）、糖尿病視網(wǎng)膜病變（DR）、糖尿病性黃斑水腫（DME）、視網(wǎng)膜靜脈阻塞（RVO）、干眼病及過敏性結(jié)膜炎等眼科疾病，發(fā)病率逐年上升，在當(dāng)前全球人口老齡化不斷加劇的背景下，這些“定時炸彈”不僅影響個人的身體健康和生活質(zhì)量，還給家庭和社會帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已成為重大公共衛(wèi)生問題和社會問題。


隨著科學(xué)技術(shù)的不斷發(fā)展以及人們對眼科疾病發(fā)病機(jī)制認(rèn)識的不斷深入，眼科治療藥物研發(fā)取得了突破性的進(jìn)展。全球藥物市場分析數(shù)據(jù)顯示，眼科藥物市場增長約是醫(yī)藥行業(yè)整體增長速度的2.5 倍[1]。越來越多的新創(chuàng)企業(yè)和生物公司加入到眼科藥物研發(fā)行列，眼科藥物開發(fā)正面臨前所未有的機(jī)遇。眼科藥動學(xué)是藥動學(xué)的一個分支，研究眼部各組織對藥物吸收、分布、代謝和排泄的時間過程，并可用數(shù)學(xué)模型進(jìn)行定量表示，相對整體藥動學(xué)更精細(xì)、復(fù)雜。





一、眼的解剖結(jié)構(gòu)

眼由眼球壁和內(nèi)容物構(gòu)成。眼球壁由三層組織構(gòu)成，外層為纖維膜（包括眼前部透明的角膜、后部白色的鞏膜及中間起連接作用的角膜緣），中層為葡萄膜（由虹膜、睫狀體和脈絡(luò)膜組成），內(nèi)層為視網(wǎng)膜。

眼內(nèi)容物包括房水、晶狀體和玻璃體，與角膜一起構(gòu)成眼的屈光系統(tǒng)。其中晶狀體是眼內(nèi)重要的透明實(shí)體組織，它位于虹膜后、玻璃體前，被晶狀體懸韌帶固定于睫狀體之間。晶狀體之前的眼結(jié)構(gòu)稱為眼前段，約占眼球的1/3，由角膜、結(jié)膜、虹膜、睫狀體、晶狀體和房水組成；晶狀體之后的眼結(jié)構(gòu)為眼后段，約占眼球的2/3，由鞏膜、脈絡(luò)膜、視網(wǎng)膜及充滿玻璃體液的玻璃體組成[2-3]。

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二、眼科藥物常見給藥途徑

眼部給藥途徑大致可分為三類：局部給藥（滴眼液、眼膏、眼凝膠等）、眼內(nèi)（玻璃體腔注射及前房注射等）或植入給藥、眼周給藥（結(jié)膜下、球后、球周、筋膜下給藥等）。用于治療眼前段疾病的藥物常采用局部給藥途徑，治療眼后段疾病的藥物常采用眼內(nèi)、眼周注射或植入給藥途徑。

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局部給藥

局部給藥患者用藥方便，可選擇性的將藥物遞送到眼前段組織中，是目前眼科藥物的主要給藥途徑。

角膜前淚液體積僅7~10 μL，且淚液每2~3 min周轉(zhuǎn)一次，因此滴眼液常采用下結(jié)膜囊給藥[2]。結(jié)膜囊最大體積約為30 μL，由于眨眼等生理反應(yīng)，大部分藥物會通過鼻淚管或面頰排出。由于眼的靜態(tài)屏障和動態(tài)屏障，最終僅有1% ～ 7% 的藥物進(jìn)入房水中。藥物一旦進(jìn)入房水，可很快分布到虹膜和睫狀體中[3]，進(jìn)入房水的少量藥物很難再進(jìn)入眼后段組織中達(dá)到有效的治療濃度，因此眼后段疾病治療藥物一般不采用局部給藥途徑。

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玻璃體腔注射

玻璃體腔給藥可將溶液、混懸液等直接注射進(jìn)入玻璃體腔中，藥物可直接與視網(wǎng)膜接觸。玻璃體腔注射藥物，一般需幾個小時才能擴(kuò)散分布至整個玻璃體腔。進(jìn)入玻璃體的藥物同時也可擴(kuò)散到眼前段組織或跨過視網(wǎng)膜內(nèi)屏障進(jìn)入視網(wǎng)膜毛細(xì)血管中消除[3]。受視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞緊密連接的阻礙，藥物從玻璃體腔轉(zhuǎn)運(yùn)到脈絡(luò)膜的速度很慢。影響玻璃體腔中藥物暴露的因素包括給藥劑量、分布容積和消除速率。玻璃體腔中藥物的清除速率主要和藥物分子量有關(guān)，小分子藥物相對大分子藥物清除速率更快。

與眼周給藥途徑相比，玻璃體腔注射可獲得更高的玻璃體、視網(wǎng)膜、脈絡(luò)膜藥物濃度，適用于眼底疾病治療藥物。但這種給藥方式會帶來嚴(yán)重的不良反應(yīng)，如眼內(nèi)炎癥、晶狀體渾濁、視網(wǎng)膜脫落、視網(wǎng)膜出血等[4]。

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眼周給藥

眼周給藥包括結(jié)膜下、球后、球周及筋膜下等給藥途徑，靠近鞏膜部位[3-4]。鞏膜是由膠原纖維構(gòu)成的纖維組織，藥物通透性較高。經(jīng)眼周給藥，藥物可穿過鞏膜，在視網(wǎng)膜和玻璃體腔中達(dá)到較高的藥物濃度，這是眼后段組織給藥最常采用的給藥方式。

  • 結(jié)膜下給藥：結(jié)膜是一種薄而半透明的黏液分泌組織，與角膜相連，覆蓋在鞏膜上方，在結(jié)膜和鞏膜之間的空隙即為結(jié)膜下。結(jié)膜下給藥一次可給予大約500 μL。


  • 筋膜下給藥：可將藥物直接注射于筋膜囊和鞏膜之間的間隙中，一次最大可注射4 mL，常用于眼科手術(shù)時的麻醉劑給藥，常見的不良反應(yīng)包括結(jié)膜下出血、結(jié)膜腫脹及眼部疼痛。
  • 球周給藥：在上下直肌和內(nèi)外直肌外側(cè)給藥，根據(jù)注射部位又分為前或后球周注射，一般用于白內(nèi)障手術(shù)時的麻醉藥物給藥，一次可注射8 ~10 mL。


  • 球后給藥：一種直接穿過眼瞼和眶筋膜將藥物注射入上下直肌和內(nèi)外直肌的肌間隙，主要用于麻醉藥物，這種給藥方式有損傷視神經(jīng)的風(fēng)險。


不同給藥途徑的優(yōu)缺點(diǎn)見下表1[5-8]。

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【表1】不同眼部給藥途徑的優(yōu)缺點(diǎn)





三、動物種屬的選擇依據(jù)

由于眼的解剖結(jié)構(gòu)存在種屬差異，不同物種眼球?qū)τ谒幬锏娜菁{體積不同，藥物在眼內(nèi)的作用方式也不同。如對于藥物-黑色素親和性的研究，應(yīng)選擇眼內(nèi)含有黑色素的有色動物。要根據(jù)藥物的性質(zhì)、劑型等特點(diǎn)選擇合適的動物種屬，從而對非臨床安全性評價數(shù)據(jù)能夠有更加科學(xué)的解釋。

人的視盤與視覺中央?yún)^(qū)域的相對位置為鼻側(cè)和顳側(cè);非人靈長類動物(NHP) 視盤與視覺中央?yún)^(qū)域的相對位置為鼻側(cè)和斜上方的眼底上半球;小型豬的視盤與視覺中央?yún)^(qū)域的相對位置為眼底下半球和上半球;而兔子與小型豬相反，視盤與視覺中央?yún)^(qū)域的相對位置為眼底上半球和下半球;貓和犬的眼球有獨(dú)特的絨氈層結(jié)構(gòu)，絨氈層是反射性的藍(lán)/綠/黃色層，位于眼底上半球，在具有絨氈層的動物眼球中，視網(wǎng)膜色素上皮層幾乎沒有色素或根本沒有色素(否則會破壞光放大作用的目的)，可使絨氈層的顏色得以顯示出來;犬的黃斑發(fā)育不完整，NHP眼底有一個橢圓形的視盤和發(fā)育良好的黃斑，有一中央動脈供應(yīng)系統(tǒng)，有中心無血管區(qū)。除NHP外很多動物都沒有黃斑區(qū)，總體上講NHP與人眼的解剖結(jié)構(gòu)最為接近。

對于眼底疾病治療的生物技術(shù)藥物，非臨床研究的動物種屬應(yīng)首選NHP。

人類約75-80% 的淚液量通過每次眨眼排出。據(jù)估計(jì)，高達(dá) 80% 的滴眼液可被吸收而分布全身，其中部分通過結(jié)膜的血管吸收，而大部分液體則通過鼻淚管系統(tǒng)直接到達(dá)高吸收性的鼻粘膜。眼瞼的大小和形狀對藥物的全身吸收也有一定的影響。眼瞼較松弛且結(jié)膜囊較大的動物（例如兔）在眨眼時可吸收比非人靈長類動物更多的“液滴”，因?yàn)榉侨遂`長類動物的眼瞼更貼緊于眼球，其通過眨眼流出到周圍皮膚和被毛上的液體量可能更高（參見圖1）。在犬和兔中所觀察到的滴眼給藥后的全身吸收是相似的。由于兔易獲得、成本低，小分子藥物常采用兔開展藥代動力學(xué)研究；大分子藥物受免疫原性及嚴(yán)重炎癥反應(yīng)影響，常采用猴開展藥代動力學(xué)研究。

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【圖1】眼瞼結(jié)構(gòu)和眼球暴露：a 食蟹猴 b 犬 c 新西蘭大白兔 d 哥廷根小型豬 e Brown Norway大鼠 f 白化小鼠


由于眨眼可影響局部給藥的供試品在眼內(nèi)的停留時間以及淚膜，因此眨眼頻率可提供不同種屬給藥后局部或全身反應(yīng)的一些解釋角度。與較慢的眨眼速率相比，更快的眨眼速率可縮短藥物在眼部的停留時間，并改變局部給藥供試品的全身吸收特征。不同種屬的眨眼頻率見表2。

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【表2】不同種屬的平均眨眼頻率[9]





四、眼組織生物樣品的采集和處理

對于眼部藥代動力學(xué)研究而言，采樣時間點(diǎn)的確定對研究結(jié)果有重大影響，若采樣點(diǎn)過少或選擇不當(dāng)，得到的眼部血藥濃度-時間曲線不能反映藥物在眼內(nèi)的實(shí)際過程，也無法獲得合理的眼部藥代動力學(xué)參數(shù)。與全身藥代動力學(xué)類似，完整的眼部血藥濃度-時間曲線應(yīng)包括藥物的吸收相、平衡相及消除相，因此采樣點(diǎn)的設(shè)計(jì)應(yīng)兼顧各個時相。整個采樣時間一般應(yīng)至少持續(xù)到峰濃度的1/10，以準(zhǔn)確判斷藥物在眼內(nèi)作用的持續(xù)時間。對具有緩、控釋作用的滴眼劑應(yīng)特別注意消除相的分布，以有效評估藥物濃度在眼內(nèi)的保持時間及藥物的消除規(guī)律。

由于眼部采樣的特殊性，一般無法在同一受試眼中連續(xù)采集生物樣品，需按不同時間點(diǎn)對受試者進(jìn)行隨機(jī)分組采樣，每個時間點(diǎn)通常至少應(yīng)有6只受試眼的數(shù)據(jù)，以減少試驗(yàn)誤差。眼部藥代動力學(xué)樣本濃度的個體差異較大，因而在正式試驗(yàn)前，通常需先選擇少量受試者進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)，并根據(jù)預(yù)試驗(yàn)的結(jié)果調(diào)整采樣點(diǎn)。

眼由多種異質(zhì)性的組織和液體組成，在進(jìn)行眼組織藥代動力學(xué)研究時，需要對各組織、液體進(jìn)行精細(xì)分離。

按照結(jié)構(gòu)組成和樣品后續(xù)處理程序的不同分為：

① 淚液，主要由蛋白、脂質(zhì)、碳水化合物和電解質(zhì)組成，可采用淚液檢測濾紙條采集；


② 房水，和血漿超濾液電解質(zhì)濃度基本相似，但房水中蛋白含量很低，約是血漿蛋白濃度的0.5%，樣品處理方法相對簡單；


③ 玻璃體液，主要由水組成，但含有膠原蛋白、透明質(zhì)酸及其他蛋白聚糖，這使玻璃體液具有凝膠樣性質(zhì)，藥物在玻璃體液中不均勻分布，因此應(yīng)將全部玻璃體液混勻后再取樣分析；


④ 角膜、鞏膜和晶狀體組織含有膠原蛋白、糖胺聚糖和蛋白聚糖，難以勻漿，需要更長或更多的勻漿處理操作；


⑤ 虹膜、睫狀體、脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜組織中存在黑色素，若藥物與黑色素結(jié)合，可能會影響藥物的檢出，樣品處理和分析時應(yīng)考慮黑色素結(jié)合對檢測結(jié)果的影響。


動物安樂死后，眼組織中的生物屏障會迅速破壞，藥物會在整個眼組織中迅速達(dá)到平衡。眼組織中的酯酶在離體條件下也有一定的活性。因此處理動物后，應(yīng)迅速摘取眼球并立即放入液氮或干冰中保存，以防止藥物轉(zhuǎn)移到鄰近組織中或被代謝消除，解剖分離眼組織時也應(yīng)全程在冷凍狀態(tài)下完成[10-11]。

結(jié)語

眼具有的特殊的解剖生理結(jié)構(gòu)和屏障系統(tǒng)，使外源藥物很難進(jìn)入眼內(nèi)。不同給藥途徑下，藥物在眼內(nèi)的藥代動力學(xué)特征和風(fēng)險也各不相同。

因此，眼科新藥非臨床研究也不同于其他藥物，藥效、藥代動力學(xué)方面需證明藥物可在靶組織中達(dá)到有效治療濃度，安全性方面需同時考察全身毒性和眼局部毒性。對于眼科新藥，應(yīng)根據(jù)擬定適應(yīng)證、用藥人群、給藥途徑、給藥期限、給藥頻率，按照“Case-by-Case”及“基于風(fēng)險”的原則分階段的開展相應(yīng)的非臨床研究，為擬開展的臨床試驗(yàn)或上市提供支持性數(shù)據(jù)。

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